آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز یک آنزیم خارج سلولی با وزن مولکولی 480 دالتون که سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده ها از جمله ساکاروز ،آب و پلیمر فروکتان می شود(شاشیکالاوهمکاران،2001؛با نگئولا و همکاران، 2006؛ارناندز و همکاران،2005). فعالیت این آنزیم در گستر ه های از فرایند ها شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس سوبتلیس) فتو پاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است(هرناندز و همکاران،1995) [5]. این آنزیم در باکتریهایی همچون ژئو باسیلوس استرئوترموفیلوس ،باسیلوس سرئوس،لاکتو باسیلوس رئوتری،لوکونوستوک مزانتروئید،استرپتوکوکوس سالیویروس، باسیلوس پلی میکسا ومخمرهای همچون آسپرژیلوس و رودوترولا و قارچ تولید می شود(بنتینگ و همکاران،2001)[6]. این آنزیم در صنایع مواد غذایی و داروسازی و همچنین در تشخیص بیماری دیابت و پاتوژنز بیماری پریودنتال استفاده می شود (پابست و همکاران، 1997؛ آلگر وهمکاران، 2004) [7].

در این تحقیق استفاده از نمونه های محیطی نه تنها سبب استخراج آنزیم مورد نظر بلکه هم در وقت و هم در هزینه صرفه جویی می شود و راندمان تولید به مراتب بیشتر خواهد شد.

1-1 پرسش اصلی تحقیق

1. آیا امکان جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز از نمونه های محیطی وجود دارد؟
2. آیا باکتریهای استخراج شده آنزیم مورد نظر را دارند؟
3. آیا پتانسیل مناسبی جهت تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز در باکتریهای محیطی وجود دارد یا خیر؟

1-2 فرضیه ها

1.پتانسیل تولید آنزیم ترانسفراز در باکتریهای محیطی در حضور بقایای گیاهی وجود دارد.

2.میزان تولید آنزیم بسته به میزان سوبسترا و دمای محیط متفاوت است

1-3 اهداف تحقیق

1.جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسقراز ازنمونه های محیطی

2.شناسایی مولکولی و تعیین سکانس ایزوله های موثر در تولید آنزیم

3.هدف کاربردی : ایجاد دانش فنی تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز

1-4 فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی

   آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز یک آنزیم خارج سلولی با وزن مولکولی 480 دالتون که سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده ها از جمله ساکاروز ،آب و پلیمر فروکتان می شود(شاشیکالاوهمکاران،2001؛با نگئولا و همکاران، 2006؛ارناندز و همکاران،2005). فعالیت این آنزیم در گستر ه های از فرایند ها شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس سوبتلیس) فتو پاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است(هرناندز و همکاران،1995) [5]. این آنزیم در باکتریهایی همچون ژئو باسیلوس استرئوترموفیلوس ،باسیلوس سرئوس،لاکتو باسیلوس رئوتری،لوکونوستوک مزانتروئید،استرپتوکوکوس سالیویروس، باسیلوس پلی میکسا ومخمرهای همچون آسپرژیلوس و رودوترولا و قارچ تولید می شود(بنتینگ و همکاران،2001)[6]. این آنزیم در صنایع مواد غذایی و داروسازی و همچنین در تشخیص بیماری دیابت و پاتوژنز بیماری پریودنتال استفاده می شود (پابست و همکاران، 1997؛ آلگر وهمکاران، 2004) [7].

در این تحقیق استفاده از نمونه های محیطی نه تنها سبب استخراج آنزیم مورد نظر بلکه هم در وقت و هم در هزینه صرفه جویی می شود و راندمان تولید به مراتب بیشتر خواهد شد.

1-1 پرسش اصلی تحقیق

1. آیا امکان جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز از نمونه های محیطی وجود دارد؟
2. آیا باکتریهای استخراج شده آنزیم مورد نظر را دارند؟
3. آیا پتانسیل مناسبی جهت تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز در باکتریهای محیطی وجود دارد یا خیر؟

1-2 فرضیه ها

1.پتانسیل تولید آنزیم ترانسفراز در باکتریهای محیطی در حضور بقایای گیاهی وجود دارد.

2.میزان تولید آنزیم بسته به میزان سوبسترا و دمای محیط متفاوت است

1-3 اهداف تحقیق

1.جداسازی باکتریهای مولد آنزیم فروکتوزیل ترانسقراز ازنمونه های محیطی

2.شناسایی مولکولی و تعیین سکانس ایزوله های موثر در تولید آنزیم

3.هدف کاربردی : ایجاد دانش فنی تولید آنزیم فروکتوزیل ترانسفراز

1-4 فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی

فروکتوزیل ترانسفراز های میکروبی، پلی مرهایی هستند که در بیوسنتز فروکتان میکروبی (لوان، اینولین، و اولیگوساکارید-قندمیوه ای) ، نقش دارند) هرناندز و همکاران،2008) [8]. از نظر ساختاری، فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی، دامنه ی کاتالیزوری خانواده ی گلیکوزید هیدرولیز 68 را به اشتراک می گذارند و در هفت گروه که از نظر فیلوژنتیک به هم مربوط می شوند، گروه بندی می گردند(هرناندز و همکاران،2008). ژن های کدگذاری شده ی فروکتوزیل ترانسفراز در اپرون ها یا گروه های مرتبط با سایر ژن هایی سازمان دهی می شوند که به ترشح متابولیسم کربوهیدرات یا فروکتوزیل ترانسفراز ارتباط دارند (هرناندز و همکاران،2008).بروز ژن فروکتوزیل ترانسفراز ، عمدتا توسط سیستم های دوجزئی یا مکانیزم های فسفریلاسیون تنظیم می شوند که به دسترسی سوکرز یا سایر سیگنال های محیطی پاسخ می دهند(هرناندز و همکاران،2008). فروکتان های میکروبی، در ایجاد مقاومت در مقابل فشار محیطی مانند بی آبی، جذب مواد غذایی، تشکیل بیوفیلم و عوامل ویرولانس، نقش دارند(اهرناندز و همکاران،2008). در نتیجه اهمیت صنعتی و بیولوژیکی فروکتان ها، فروکتوزیل ترانسفراز ، موضوع تحقیقات فراوانی بوده است که برای بهبود فعالیت آنزیمی یا مشخص کردن نقش بیولوژیکی آنها در طبیعت، انجام شده اند(هرناندز و همکاران،2008).

   لوان سوکراز ( سوکروز 2,6 β-D فروکتان 6, β-D فروکتوزیل ترانسفراز)،از باکتریهای گرم-مثبت همچون باسیلوس.سابتیلیس، باسیلوس.ناتو،باسیلوس.پلی میکسا، باسیلوس. استرپتوکوکوس. موتانس، استرپتوکوکوس. سالیواروس، اکتینومایسس.ویسکوس،اکتینومایسس.نیوزلندی وگرم-منفی همچون اروینیا. آمیلوورا، زایموموناس. موبیلیس، استوباکتر.ساب اکسیداز،گلوکونوباکتر. اکسیداز،پانتوا.آگلومرانس، قارچ های همانند آسپرژیلوس و رودوترولا جدا شده است(دونا و همکاران،1999)[9]. فروکتوزیل ترانسفراز 4 واکنش را کاتالیز میکند،تبدیل،هیدرولیز،ترانسفروکتوزیل،پلیمریزاسیون(هرناندزوهمکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفراز سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده های مختلف مانندآب در واکنش هیدرولیز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز یا فروکتان در پلی مریزاسیون استفاده می کند (شاشیکالا و همکاران،2001). این آنزیم دارای 3 ویژگی 1: سنتز لوان از سوکروز از طریق واکنش ترانس فروکتوزیلاسیون 2: هیدرولیز لوان به مونوساکارید فروکتوز 3: تبدیل فروکتوز به گلوکز (شاشیکالا و همکاران،2001).

فروکتوزیل ترانسفراز دارای 2 سوبسترا سوکروز و 6,2 β-D فروکتوزیل که طی واکنش گلیکوزیل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 6,2 β-D فروکتوزیل را تولید می کند(شاشیکالا و همکاران، 2001). این آنزیم دارای وزن مولکولی 480 کیلو دالتون است و فعالیت این آنزیم در گستره های از فرایندهایی شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس.سابتیلیس) فتوپاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس .پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است (هرناندز و همکاران،1995).

1-5 فروکتان ها

 شکل 1-1 طبقه بندی انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجیره β-D فروکتوزیل با سوکروز( هرناندز و همکاران 2008)

 1-6 بیوسنتزفروکتان میکروبی

گیاهان حداقل به دو فعالیت آنزیمی مجزا احتیاج دارند تا واکنش های اولیه و مدت دار در بیوسنتزرا کاتالیز کنند(هرناندز و همکاران،2008). در مقابل، بیوسنتز فروکتان ها، نیازمند یک فعالیت فروکتوزیل ترانسفراز برای هردو واکنش می باشد(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای بر طبق روال روبرو دسته بندی شده اند: (1)نوع اتصال میان واحدهای فروکتوزیل β-D در پلیمر که سنتز می کنند (2) ویژگی آنزیمی خود(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای ، یک باقی ماندهی فروکتوزیل را به یک مولکول پذیرنده ی سوکرز انتقال می دهند که این عمل بر طبق واکنش کلی می باشد:

O- β – D – fructofuranosyl – (2 – 1)- -αD-glucopyranoside +) β -D- fructofuranosyl -( n

– β -D-fructofuranosyl-(2 -1)- -α-D-glucopyranoside) = o- -α D – glucopyranoside – + (β -D

-fructofuranosyl–( _n+1 – β – D – fructofuranosyl-(2 – 1)- -αD- glucopyranoside

   همچنین، فروکتوزیل ترانسفرازهای ، سنتز لوان را نیز کاتالیز می کند اما آنها هیدرولیز را کاتالیز نمی کنند یا مانند لوان سوکرازهای ، واکنش ها را تبادل نمی کنند(هرناندز و همکاران،2008). ویژگی های جنبشی فروکتوزیل تراسنفراز ، در جدول شماره 1، فهرست شده اند. وزن های مولکولی مابین 75 و 180 کیلو دالتون، pH بهینه 4.5-7.5، و مقادیر km برای سوکرز، 5.0-770.4 مول می باشند(هرناندز و همکاران،2008). آنزیم های رودوترولا LEB-V10 و آسپرژیلوس آکولئاتوس، از نوع دیمری می باشند(قاضی و همکاران،2007؛ هرنال استینس و مایوگری،2008)[30]

فروکتوزیل ترانسفراز های میکروبی، پلی مرهایی هستند که در بیوسنتز فروکتان میکروبی (لوان، اینولین، و اولیگوساکارید-قندمیوه ای) ، نقش دارند) هرناندز و همکاران،2008) [8]. از نظر ساختاری، فروکتوزیل ترانسفراز میکروبی، دامنه ی کاتالیزوری خانواده ی گلیکوزید هیدرولیز 68 را به اشتراک می گذارند و در هفت گروه که از نظر فیلوژنتیک به هم مربوط می شوند، گروه بندی می گردند(هرناندز و همکاران،2008). ژن های کدگذاری شده ی فروکتوزیل ترانسفراز در اپرون ها یا گروه های مرتبط با سایر ژن هایی سازمان دهی می شوند که به ترشح متابولیسم کربوهیدرات یا فروکتوزیل ترانسفراز ارتباط دارند (هرناندز و همکاران،2008).بروز ژن فروکتوزیل ترانسفراز ، عمدتا توسط سیستم های دوجزئی یا مکانیزم های فسفریلاسیون تنظیم می شوند که به دسترسی سوکرز یا سایر سیگنال های محیطی پاسخ می دهند(هرناندز و همکاران،2008). فروکتان های میکروبی، در ایجاد مقاومت در مقابل فشار محیطی مانند بی آبی، جذب مواد غذایی، تشکیل بیوفیلم و عوامل ویرولانس، نقش دارند(اهرناندز و همکاران،2008). در نتیجه اهمیت صنعتی و بیولوژیکی فروکتان ها، فروکتوزیل ترانسفراز ، موضوع تحقیقات فراوانی بوده است که برای بهبود فعالیت آنزیمی یا مشخص کردن نقش بیولوژیکی آنها در طبیعت، انجام شده اند(هرناندز و همکاران،2008).

   لوان سوکراز ( سوکروز 2,6 β-D فروکتان 6, β-D فروکتوزیل ترانسفراز)،از باکتریهای گرم-مثبت همچون باسیلوس.سابتیلیس، باسیلوس.ناتو،باسیلوس.پلی میکسا، باسیلوس. استرپتوکوکوس. موتانس، استرپتوکوکوس. سالیواروس، اکتینومایسس.ویسکوس،اکتینومایسس.نیوزلندی وگرم-منفی همچون اروینیا. آمیلوورا، زایموموناس. موبیلیس، استوباکتر.ساب اکسیداز،گلوکونوباکتر. اکسیداز،پانتوا.آگلومرانس، قارچ های همانند آسپرژیلوس و رودوترولا جدا شده است(دونا و همکاران،1999)[9]. فروکتوزیل ترانسفراز 4 واکنش را کاتالیز میکند،تبدیل،هیدرولیز،ترانسفروکتوزیل،پلیمریزاسیون(هرناندزوهمکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفراز سبب تسریع انتقال واحد فروکتوزیل به تعدادی از پذیرنده های مختلف مانندآب در واکنش هیدرولیز سوکروز، گلوکز در واکنش تبادل، سوکروز یا فروکتان در پلی مریزاسیون استفاده می کند (شاشیکالا و همکاران،2001). این آنزیم دارای 3 ویژگی 1: سنتز لوان از سوکروز از طریق واکنش ترانس فروکتوزیلاسیون 2: هیدرولیز لوان به مونوساکارید فروکتوز 3: تبدیل فروکتوز به گلوکز (شاشیکالا و همکاران،2001).

فروکتوزیل ترانسفراز دارای 2 سوبسترا سوکروز و 6,2 β-D فروکتوزیل که طی واکنش گلیکوزیل ترانسفراز 2 محصول گلوکز و 6,2 β-D فروکتوزیل را تولید می کند(شاشیکالا و همکاران، 2001). این آنزیم دارای وزن مولکولی 480 کیلو دالتون است و فعالیت این آنزیم در گستره های از فرایندهایی شامل بقای باکتری در خاک (باسیلوس.سابتیلیس) فتوپاتوژنسیس (اروینیا و سودوموناس) همزیستی (باسیلوس .پلی میکسا) و متابولیسم فروکتان در گیاهان است (هرناندز و همکاران،1995).

1-5 فروکتان ها

 شکل 1-1 طبقه بندی انواع فروکتان ها بر اساس نوع اتصال زنجیره β-D فروکتوزیل با سوکروز( هرناندز و همکاران 2008)

 1-6 بیوسنتزفروکتان میکروبی

گیاهان حداقل به دو فعالیت آنزیمی مجزا احتیاج دارند تا واکنش های اولیه و مدت دار در بیوسنتزرا کاتالیز کنند(هرناندز و همکاران،2008). در مقابل، بیوسنتز فروکتان ها، نیازمند یک فعالیت فروکتوزیل ترانسفراز برای هردو واکنش می باشد(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای بر طبق روال روبرو دسته بندی شده اند: (1)نوع اتصال میان واحدهای فروکتوزیل β-D در پلیمر که سنتز می کنند (2) ویژگی آنزیمی خود(هرناندز و همکاران،2008). فروکتوزیل ترانسفرازهای ، یک باقی ماندهی فروکتوزیل را به یک مولکول پذیرنده ی سوکرز انتقال می دهند که این عمل بر طبق واکنش کلی می باشد:

O- β – D – fructofuranosyl – (2 – 1)- -αD-glucopyranoside +) β -D- fructofuranosyl -( n

– β -D-fructofuranosyl-(2 -1)- -α-D-glucopyranoside) = o- -α D – glucopyranoside – + (β -D

-fructofuranosyl–( _n+1 – β – D – fructofuranosyl-(2 – 1)- -αD- glucopyranoside

   همچنین، فروکتوزیل ترانسفرازهای ، سنتز لوان را نیز کاتالیز می کند اما آنها هیدرولیز را کاتالیز نمی کنند یا مانند لوان سوکرازهای ، واکنش ها را تبادل نمی کنند(هرناندز و همکاران،2008). ویژگی های جنبشی فروکتوزیل تراسنفراز ، در جدول شماره 1، فهرست شده اند. وزن های مولکولی مابین 75 و 180 کیلو دالتون، pH بهینه 4.5-7.5، و مقادیر km برای سوکرز، 5.0-770.4 مول می باشند(هرناندز و همکاران،2008). آنزیم های رودوترولا LEB-V10 و آسپرژیلوس آکولئاتوس، از نوع دیمری می باشند(قاضی و همکاران،2007؛ هرنال استینس و مایوگری،2008)[30]