فناوری کشت بافت و سلول در دومین انقلاب سبز، که بر اساس تغییر ژن و دستکاری ژنتیکی برای بهبود کیفیت و کمیت محصولات پایه گذاری شد، نقش کلیدی دارد. کشت بافت و سلول گیاهی به روشی گفته می‌شود که اجزای مختلف گیاه شامل سلول، پروتوپلاست، جنین، بافت، اندام و غیره در شرایط آزمایشگاهی و به طور کامل سترون روی یک محیط غذایی قرار می‌گیرند و در شرایط محیطی مناسب نگهداری می‌شوند. این روش در سطح کم وسعت در مقایسه با کشت های مزرعه‌ای و با بهره گرفتن از محیط غذایی مشخص و عاری از هر گونه آلودگی صورت می‌گیرد .

   روش‌های اصلی برای ایجاد کالوس‌دهی و باززایی، شامل روش‌هایی است که هم کاربرد تجاری مستقیم دارند و به همان اندازه نیز امکان پژوهش‌های پایه‌های ژنتیکی و بیو شیمیایی در سلول را فراهم می‌آورند. این روش‌ها شامل انواع کشت بافت و سلول‌های گیاهی، مانند بساک، تخمک (تخمدان)، بذر، ساقه، برگ، کالوس، جداسازی پروتوپلاست و امتزاج آنها، انتخاب سلول، کشت مریستم و جوانه، و همچنین تغییر ژنتیکی سلول‌ها و گیاهان است (سید طباطبایی و امیدی، 1388).

امروزه از تکنیک‌های کشت بافت در سراسر جهان به منظور تولید بسیاری از گیاهان با اهداف گوناگون استفاده می‌شود. این تکنیک‌ها دامنه وسیعی از روش‌های مختلف را بسته به محیط‌های کشت مورد استفاده، ریزنمونه مورد نظر، چگونگی انتقال از فازهای مختلف فرایند و … را در بر می‌گیرند.

یکی از مهم‌ترین روش‌های کشت بافت، ریزازدیادی است که به منظور تکثیر انبوه گیاهان در زمانی کوتاه به کار می‌رود. در این روش از قسمت‌های مختلف گیاه ریزنمونه تهیه شده و با بهره گرفتن از ترکیبات غذایی و هورمونی مناسب مستقیماً به فاز باززایی هدایت می‌شوند. در واقع این تکنیک می‌تواند جایگزینی برای روش‌های سنتی تکثیر غیر جنسی در بسیاری از گیاهان باشد.

یک روش بسیار پرکاربرد ریزازدیادی کشت مریستم و نوک ساقه است. مریستم شامل سلول‌های به سرعت در حال تقسیم است، از این رو از این تکنیک برای تولید تجاری گیاهان و همین طور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور وسیعی استفاده می‌شود. گیاهان به دست آمده از این طریق، پایداری ژنتیکی زیادی نشان می‌دهند، از این رو برای انجام تحقیقات بیوتکنولوژیکی بسیار مناسب هستند.

1-2- تاریخچه آلسترومریا

آلسترومریا به طور معمول با بهره گرفتن از ریزوم تکثیر می‌شود، اما آلودگی‌های ویروسی، سرعت کم تکثیر و محدودیت‌های فصلی، سبب محدود شدن استفاده از این روش شده است (وان و همکاران، 1996).

شکل 1-1- نمونه‌هایی از گل آلسترومریا

شکل 1-2- گل آلسترومریا رقم Fuego

درحال حاضر برای فایق آمدن بر مشکلات روش‌های معمول تکثیر این گیاه زینتی و تولید گیاهان عاری از ویروس، استفاده از روش‌های کشت درون شیشه‌ای در این گیاه اهمیت زیادی پیدا کرده است. برای تکثیر این‌ویتروی آلسترومریا معمولاً از ریزنمونه‌های جوانه انتهایی شاخه (پدراز سانتوز و همکاران،2005)، جوانه جانبی (لین و همکاران، 1997) و ریزوم (لین و همکاران، 1987) استفاده می‌گردد. با این وجود سرعت باززایی جوانه انتهایی ریزوم (نوک ریزوم) از سایر ریزنمونه‌ها بیشتر گزارش شده است (لین و همکاران، 1987).

1-3- مشخصات گیاه‌شناسی آلسترومریا

آلسترمریا (Alstromeria) از گیاهان زیر رده تک لپه‌ایها متعلق به خانواده آلسترومریاسه می‌باشد. آلسترومریا گیاهی است علفی، چند ساله، ریزوم دار با گلهایی به رنگ‌های مختلف که حدود 60 گونه دارد که منشا همگی از جنوب آمریکا می‌باشد (بیکر، 1888؛ آفوت، 1952؛ رابینسون، 1963). آلسترومریا دارای انواع مختلفی می‌باشند که می‌توانند در شرایط گوناگونی همچون سواحل شنی (A.peregrina L.)، بیابانها (A.Violacea phil)، جلگه‌های آبرفتی (A.heamantha Ruiz)، دشتهای نیمه جنگلی (A.aurantiaca D.Don ) و مناطق سرد کوهستانی (A. Nivalis phil. In Lin) رشد و نمو کنند (هنس و ویلکینز، 1979 ). این گیاه دارای ریزوم‌های سفیدی می‌باشد که از آن

فناوری کشت بافت و سلول در دومین انقلاب سبز، که بر اساس تغییر ژن و دستکاری ژنتیکی برای بهبود کیفیت و کمیت محصولات پایه گذاری شد، نقش کلیدی دارد. کشت بافت و سلول گیاهی به روشی گفته می‌شود که اجزای مختلف گیاه شامل سلول، پروتوپلاست، جنین، بافت، اندام و غیره در شرایط آزمایشگاهی و به طور کامل سترون روی یک محیط غذایی قرار می‌گیرند و در شرایط محیطی مناسب نگهداری می‌شوند. این روش در سطح کم وسعت در مقایسه با کشت های مزرعه‌ای و با بهره گرفتن از محیط غذایی مشخص و عاری از هر گونه آلودگی صورت می‌گیرد .

   روش‌های اصلی برای ایجاد کالوس‌دهی و باززایی، شامل روش‌هایی است که هم کاربرد تجاری مستقیم دارند و به همان اندازه نیز امکان پژوهش‌های پایه‌های ژنتیکی و بیو شیمیایی در سلول را فراهم می‌آورند. این روش‌ها شامل انواع کشت بافت و سلول‌های گیاهی، مانند بساک، تخمک (تخمدان)، بذر، ساقه، برگ، کالوس، جداسازی پروتوپلاست و امتزاج آنها، انتخاب سلول، کشت مریستم و جوانه، و همچنین تغییر ژنتیکی سلول‌ها و گیاهان است (سید طباطبایی و امیدی، 1388).

امروزه از تکنیک‌های کشت بافت در سراسر جهان به منظور تولید بسیاری از گیاهان با اهداف گوناگون استفاده می‌شود. این تکنیک‌ها دامنه وسیعی از روش‌های مختلف را بسته به محیط‌های کشت مورد استفاده، ریزنمونه مورد نظر، چگونگی انتقال از فازهای مختلف فرایند و … را در بر می‌گیرند.

یکی از مهم‌ترین روش‌های کشت بافت، ریزازدیادی است که به منظور تکثیر انبوه گیاهان در زمانی کوتاه به کار می‌رود. در این روش از قسمت‌های مختلف گیاه ریزنمونه تهیه شده و با بهره گرفتن از ترکیبات غذایی و هورمونی مناسب مستقیماً به فاز باززایی هدایت می‌شوند. در واقع این تکنیک می‌تواند جایگزینی برای روش‌های سنتی تکثیر غیر جنسی در بسیاری از گیاهان باشد.

یک روش بسیار پرکاربرد ریزازدیادی کشت مریستم و نوک ساقه است. مریستم شامل سلول‌های به سرعت در حال تقسیم است، از این رو از این تکنیک برای تولید تجاری گیاهان و همین طور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور وسیعی استفاده می‌شود. گیاهان به دست آمده از این طریق، پایداری ژنتیکی زیادی نشان می‌دهند، از این رو برای انجام تحقیقات بیوتکنولوژیکی بسیار مناسب هستند.

1-2- تاریخچه آلسترومریا

آلسترومریا به طور معمول با بهره گرفتن از ریزوم تکثیر می‌شود، اما آلودگی‌های ویروسی، سرعت کم تکثیر و محدودیت‌های فصلی، سبب محدود شدن استفاده از این روش شده است (وان و همکاران، 1996).

شکل 1-1- نمونه‌هایی از گل آلسترومریا

شکل 1-2- گل آلسترومریا رقم Fuego

درحال حاضر برای فایق آمدن بر مشکلات روش‌های معمول تکثیر این گیاه زینتی و تولید گیاهان عاری از ویروس، استفاده از روش‌های کشت درون شیشه‌ای در این گیاه اهمیت زیادی پیدا کرده است. برای تکثیر این‌ویتروی آلسترومریا معمولاً از ریزنمونه‌های جوانه انتهایی شاخه (پدراز سانتوز و همکاران،2005)، جوانه جانبی (لین و همکاران، 1997) و ریزوم (لین و همکاران، 1987) استفاده می‌گردد. با این وجود سرعت باززایی جوانه انتهایی ریزوم (نوک ریزوم) از سایر ریزنمونه‌ها بیشتر گزارش شده است (لین و همکاران، 1987).

1-3- مشخصات گیاه‌شناسی آلسترومریا

آلسترمریا (Alstromeria) از گیاهان زیر رده تک لپه‌ایها متعلق به خانواده آلسترومریاسه می‌باشد. آلسترومریا گیاهی است علفی، چند ساله، ریزوم دار با گلهایی به رنگ‌های مختلف که حدود 60 گونه دارد که منشا همگی از جنوب آمریکا می‌باشد (بیکر، 1888؛ آفوت، 1952؛ رابینسون، 1963). آلسترومریا دارای انواع مختلفی می‌باشند که می‌توانند در شرایط گوناگونی همچون سواحل شنی (A.peregrina L.)، بیابانها (A.Violacea phil)، جلگه‌های آبرفتی (A.heamantha Ruiz)، دشتهای نیمه جنگلی (A.aurantiaca D.Don ) و مناطق سرد کوهستانی (A. Nivalis phil. In Lin) رشد و نمو کنند (هنس و ویلکینز، 1979 ). این گیاه دارای ریزوم‌های سفیدی می‌باشد که از آن شاخه‌های هوایی منشا می‌گیرند. شاخه‌ها بسته به دمای خاک، طول روز و شدت نور می‌توانند بصورت رویشی یا زایشی باشند (وانک نوردیروف، 1975؛ هیلی و همکاران، 1982).

گل‌ها در انتهای ساقه به صورت گل‌آذین گرزن تشکیل می‌شوند که هر گل‌آذین بسته به فصل رشد، شدت نور، و اندازه و قدرت رشدی گیاه بیش از 4 گلچه دارد (هیوز و همکاران، 1986). گل‌ها به رنگ‌های مختلفی از زرد تا قرمز، دیپلوئید و دارای 2n=16 کروموزوم و ناهمرس می‌باشند، یعنی قبل از اینکه کلاله پذیرا گردد پرچم‌ها باز شده و دانه‌های گرده خود را رها می‌کنند (دارلینگتون و وایلی، 1955). در میان کولتیوارها، تتراپلوئید نیز وجود دارد. برگها نیز به صورت متناوب با لبه صاف می‌باشند (پاول و همکاران، 1986 ).

شکل 1-3- شمایی از گل آلسترومریا

آلسترومریا دارای یک ریزوم زیرزمینی است كه از آن شاخه‌های عمودی رشد و نمو می‌نمایند. ریزوم اصلی عموماً ریزومهای جانبی جدیدی تولید می کند كه آن شاخه گل‌دهنده را تولید می کند، در سطح خاك شاخه‌ها تولید هیچ شاخه جانبی نمی‌نمایند بنابراین اكثر قسمت‌های گیاه در زیرزمین توسعه پیدا می‌كند دمای خاك نقش مهمی را در این توسعه ایفا می کند. بعد ازیک دوره دمای بالای خاك، گیاه شاخه‌های زیادی تولید می کند (ریزوم جدید) که بسته به نوع واریته بسیاری از این شاخه‌ها باقی می‌‌مانند (تولید گل نمی‌نمایند).

   یک شاخه آلسترومریا از هر یک ازجوانه‌های جانبی نزدیک نوك شاخه،7-3 شاخه گل تولید می کند انواع مختلف آلسترومریا وجود دارد (اركیده – پروانه ای و آئورا نتیكا) اما اكثر گونه‌های امروزی هیبرید هستند گرچه در طول مدت سال تولید می‌نمایند ولی پیک آن در بهار و اغلب در پائیز است وقتی كه خاك مصرفی( بستر كشت) سرد است.

شکل 1-4- شمای از شکل ریزوم که در آن ریشه‌ها و شاخه‌های هوایی منشا می‌گیرند.

1-4- روش‌های تکثیر آلسترومریا

1-4-1- تکثیر جنسی

به طور معمول از تکثیر آلسترومریا به وسیله بذر به علت تغییر پذیری ژنتیکی و مشکلات جوانه‌زنی بذر که وجود دارد باید پرهیز کرد. بذرها بعلت گران نبودن و ازدیاد سریع مزیت دارند. بذرهایی که یک سال از برداشت آنها گذشته، اگر چهار هفته در شرایط مرطوب و گرم (18 تا 25 درجه سانتی گراد) قرار گرفته و بعد چهار هفته در شرایط مرطوب و سرد (7 درجه سانتی‌گراد) قرار گیرند، طی هشت تا ده هفته جوانه خواهند زد. برای کثیر آلسترومریا، از بذر کمتر استفاده می‌شود خصوصاً اینکه تکثیر از این طریق سبب ایجاد تفرق صفات می‌گردد (ناصری، 1377).

1-4-2- تکثیر از طریق رویشی

گیاهان آلسترومریا، به طور معمول از طریق رویشی توسط تقسیم ریزوم تکثیر می‌شوند. معمولاً گیاهان را در ماه های شهریور و مهر از زمین خارج می‌کنند. بایستی مراقب بود که جوانه‌های جانبی و انتهایی ریزوم و همچنین ریشه‌ها آسیبی نبینند. سپس ریزوم‌ها را به قطعات 5 سانتی متری که حاوی جوانه جانبی یا انتهایی باشند تقسیم می‌کنند. بسترهای کشت بایستی از قبل آماده شده باشند تا تقسیم و کشت بعدی گیاهان به سرعت انجام شود. جهت کنترل بیماری‌ها، توصیه شده که ریزوم‌ها در زمان کشت با قارچ کشها ضدعفونی شوند. پس از کشت، تنها زمانی که بستر کشت خشک شد آبیاری انجام می‌شود زیرا آبیاری و رطوبت بیش از حد موجب پوسیدگی ریزوم‌ها می‌گردد. معمولاً پس از 4 تا 8 هفته در دمای 18 درجه سانتی‌گراد ریزوم‌ها کاملاً مستقر می‌شوند. بعد از این دوره، دما را به 5/4 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 تا 6 هفته کاهش می‌دهند تا عمل بهاره‌سازی ریزوم‌ها صورت گیرد و گلدهی تحریک گردد (هیلی و ویلکینز، 1981).

1-4-3- تکثیر از طریق کشت بافت

 گونه‌های وحشی آلسترومریا بطور معمول برای تولید گل‌های شاخه بریده تجاری مناسب نیستند. آنها دارای دوره گلدهی کوتاه و برگ‌هایی با کیفیت پائین می‌باشند. با این حال، کولتیوارها و هیبریدهای تجاری از طریق تلاقی‌های بین گونه‌ای و تیمارهای پرتوافکنی بدست آمده‌اند (گومانس، 1962؛ برورتجس و وربوم، 1974 ).

آلسترمریاهای جدید بدلیل داشتن گل‌های درشت با تنوع وسیعی از رنگ‌ها و تشکیل گل‌هایی زیبا با طول عمر پس از برداشت بالا (تا حدود 14 روز) بسیار با ارزش می‌باشند (هیلی و ویلکینز، 1981).

 شاخه‌های هوایی منشا می‌گیرند. شاخه‌ها بسته به دمای خاک، طول روز و شدت نور می‌توانند بصورت رویشی یا زایشی باشند (وانک نوردیروف، 1975؛ هیلی و همکاران، 1982).

گل‌ها در انتهای ساقه به صورت گل‌آذین گرزن تشکیل می‌شوند که هر گل‌آذین بسته به فصل رشد، شدت نور، و اندازه و قدرت رشدی گیاه بیش از 4 گلچه دارد (هیوز و همکاران، 1986). گل‌ها به رنگ‌های مختلفی از زرد تا قرمز، دیپلوئید و دارای 2n=16 کروموزوم و ناهمرس می‌باشند، یعنی قبل از اینکه کلاله پذیرا گردد پرچم‌ها باز شده و دانه‌های گرده خود را رها می‌کنند (دارلینگتون و وایلی، 1955). در میان کولتیوارها، تتراپلوئید نیز وجود دارد. برگها نیز به صورت متناوب با لبه صاف می‌باشند (پاول و همکاران، 1986 ).

شکل 1-3- شمایی از گل آلسترومریا

آلسترومریا دارای یک ریزوم زیرزمینی است كه از آن شاخه‌های عمودی رشد و نمو می‌نمایند. ریزوم اصلی عموماً ریزومهای جانبی جدیدی تولید می کند كه آن شاخه گل‌دهنده را تولید می کند، در سطح خاك شاخه‌ها تولید هیچ شاخه جانبی نمی‌نمایند بنابراین اكثر قسمت‌های گیاه در زیرزمین توسعه پیدا می‌كند دمای خاك نقش مهمی را در این توسعه ایفا می کند. بعد ازیک دوره دمای بالای خاك، گیاه شاخه‌های زیادی تولید می کند (ریزوم جدید) که بسته به نوع واریته بسیاری از این شاخه‌ها باقی می‌‌مانند (تولید گل نمی‌نمایند).

   یک شاخه آلسترومریا از هر یک ازجوانه‌های جانبی نزدیک نوك شاخه،7-3 شاخه گل تولید می کند انواع مختلف آلسترومریا وجود دارد (اركیده – پروانه ای و آئورا نتیكا) اما اكثر گونه‌های امروزی هیبرید هستند گرچه در طول مدت سال تولید می‌نمایند ولی پیک آن در بهار و اغلب در پائیز است وقتی كه خاك مصرفی( بستر كشت) سرد است.

شکل 1-4- شمای از شکل ریزوم که در آن ریشه‌ها و شاخه‌های هوایی منشا می‌گیرند.

1-4- روش‌های تکثیر آلسترومریا

1-4-1- تکثیر جنسی

به طور معمول از تکثیر آلسترومریا به وسیله بذر به علت تغییر پذیری ژنتیکی و مشکلات جوانه‌زنی بذر که وجود دارد باید پرهیز کرد. بذرها بعلت گران نبودن و ازدیاد سریع مزیت دارند. بذرهایی که یک سال از برداشت آنها گذشته، اگر چهار هفته در شرایط مرطوب و گرم (18 تا 25 درجه سانتی گراد) قرار گرفته و بعد چهار هفته در شرایط مرطوب و سرد (7 درجه سانتی‌گراد) قرار گیرند، طی هشت تا ده هفته جوانه خواهند زد. برای کثیر آلسترومریا، از بذر کمتر استفاده می‌شود خصوصاً اینکه تکثیر از این طریق سبب ایجاد تفرق صفات می‌گردد (ناصری، 1377).

1-4-2- تکثیر از طریق رویشی

گیاهان آلسترومریا، به طور معمول از طریق رویشی توسط تقسیم ریزوم تکثیر می‌شوند. معمولاً گیاهان را در ماه های شهریور و مهر از زمین خارج می‌کنند. بایستی مراقب بود که جوانه‌های جانبی و انتهایی ریزوم و همچنین ریشه‌ها آسیبی نبینند. سپس ریزوم‌ها را به قطعات 5 سانتی متری که حاوی جوانه جانبی یا انتهایی باشند تقسیم می‌کنند. بسترهای کشت بایستی از قبل آماده شده باشند تا تقسیم و کشت بعدی گیاهان به سرعت انجام شود. جهت کنترل بیماری‌ها، توصیه شده که ریزوم‌ها در زمان کشت با قارچ کشها ضدعفونی شوند. پس از کشت، تنها زمانی که بستر کشت خشک شد آبیاری انجام می‌شود زیرا آبیاری و رطوبت بیش از حد موجب پوسیدگی ریزوم‌ها می‌گردد. معمولاً پس از 4 تا 8 هفته در دمای 18 درجه سانتی‌گراد ریزوم‌ها کاملاً مستقر می‌شوند. بعد از این دوره، دما را به 5/4 درجه سانتی‌گراد به مدت 4 تا 6 هفته کاهش می‌دهند تا عمل بهاره‌سازی ریزوم‌ها صورت گیرد و گلدهی تحریک گردد (هیلی و ویلکینز، 1981).

1-4-3- تکثیر از طریق کشت بافت

 گونه‌های وحشی آلسترومریا بطور معمول برای تولید گل‌های شاخه بریده تجاری مناسب نیستند. آنها دارای دوره گلدهی کوتاه و برگ‌هایی با کیفیت پائین می‌باشند. با این حال، کولتیوارها و هیبریدهای تجاری از طریق تلاقی‌های بین گونه‌ای و تیمارهای پرتوافکنی بدست آمده‌اند (گومانس، 1962؛ برورتجس و وربوم، 1974 ).

آلسترمریاهای جدید بدلیل داشتن گل‌های درشت با تنوع وسیعی از رنگ‌ها و تشکیل گل‌هایی زیبا با طول عمر پس از برداشت بالا (تا حدود 14 روز) بسیار با ارزش می‌باشند (هیلی و ویلکینز، 1981).