زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.

روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با بهره گرفتن از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.

نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد.

محیط­های خشن (Extreme) یکی از محیط های پرچالش برای ارگانیسم های زنده است. با این حال، تعداد زیادی از میکروارگانیسم­های متعلق به سه قلمرو حیات (باکتری­ ها، یوکاریوت­ها و آرکی­ها) از محیط­های خشن مانند هیدروترمال و محیط­های خشک در معرض اشعه UV، محیط های بسیار گرم جداسازی شده اند. در میان این ارگانیسم­های مقاوم به شرایط خشن، باکتری­ های متعلق به خانواده Deinococcaceae توانایی بسیار بالایی برای زیستن در محیط های در معرض اشعه های یونیزان دارند و Deinococcus radiodurans یکی از بهترین گونه هایی است مورد مطالعه قرار گرفته است.

این باکتری توسط توانایی استثنایی اش در مقابله با اثرات تخریب کننده ساختار DNA از جمله اشعه یونیزان، نور ماورای بنفش و شرایط خشکی مورد شناسایی قرار گرفته است.

اشعه­های یونیزان توسط تخریب عناصر رادیواکتیو تولید می شود و منجر به تولید الکترون ها و یون های مختلف می شود. اشعه های گاما فوتون هایی هستند که مولکول های سلولی را تغییر می دهند و رادیکال های هیدروکسیل بسیار فعال تولید می کنند (ROS) بخصوص OH^. توسط یونیزاسیون مولکول های آب. این رادیکال های آزاد

زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.

روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با بهره گرفتن از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.

نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد.

محیط­های خشن (Extreme) یکی از محیط های پرچالش برای ارگانیسم های زنده است. با این حال، تعداد زیادی از میکروارگانیسم­های متعلق به سه قلمرو حیات (باکتری­ ها، یوکاریوت­ها و آرکی­ها) از محیط­های خشن مانند هیدروترمال و محیط­های خشک در معرض اشعه UV، محیط های بسیار گرم جداسازی شده اند. در میان این ارگانیسم­های مقاوم به شرایط خشن، باکتری­ های متعلق به خانواده Deinococcaceae توانایی بسیار بالایی برای زیستن در محیط های در معرض اشعه های یونیزان دارند و Deinococcus radiodurans یکی از بهترین گونه هایی است مورد مطالعه قرار گرفته است.

این باکتری توسط توانایی استثنایی اش در مقابله با اثرات تخریب کننده ساختار DNA از جمله اشعه یونیزان، نور ماورای بنفش و شرایط خشکی مورد شناسایی قرار گرفته است.

اشعه­های یونیزان توسط تخریب عناصر رادیواکتیو تولید می شود و منجر به تولید الکترون ها و یون های مختلف می شود. اشعه های گاما فوتون هایی هستند که مولکول های سلولی را تغییر می دهند و رادیکال های هیدروکسیل بسیار فعال تولید می کنند (ROS) بخصوص OH^. توسط یونیزاسیون مولکول های آب. این رادیکال های آزاد بطور مستقیم و غیرمستقیم باعث تخریب DNA می شوند و تغییرات بازی و شکست دورشته و تک رشته DNA را بوجود می آورند. مطالعات نشان می دهد که 80% از تخریب DNA ناشی از عملکرد ROS است و فقط 20% توسط برهم کنش مستقیم فوتون های گاما و DNA است و تعداد شکست های DNA دو رشته ای نسبت مستقیم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E , 2001). اولین مسیر حفاظت علیه استرس اکسیداتیو وجود آنزیم های آنتی اکسیدان همانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز است که بیومولکول ها را از آسیب هاب ناشی از ROS محافظت می کند (شکل 1). سوپراکسید دیسموتاز تبدیل اکسیژن را به سوپراکسید اکسیژن کاتالیر می کند تا در نهایت پراکسید هیدروژن به H₂O تبدیل شود (شکل 1). مطالعات نشان می دهد که D. radiodurans در هنگام مواجه با اشعه یونیزان سه نوع سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز کد می کند. در آرکی ها، سوپراکسید دیسموتاز توسط ارگانیسم­های هوازی (نظیر Halobacterium) و چند ارگانیسم بی هوازی مانند Methanosarcina barkeri کد می شود. در ارگانیسم های بی هوازی سوپراکسید ردوکتاز (SOR) کد می شود (شکل 1). سوپراکسید ردوکتاز در هنگام اکسیده شدن نیاز دارد تا توسط روبردوکسین احیا شود که خودش هم توسط آنزیم NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز (NROR) اکسیده می شود. در نهایت پراکسید به H₂O توسط عملکرد روبرترین تبدیل می شود. علاوه بر این، بعضی از ارگانیسم های بی هوازی، از مسیرهای بدون تولید پراکسید هیدروژن، برای حذف سوپراکسید استفاده می کنند (تصویر C1). مطالعات کریستالوگرافی نشان می دهد که سوپراکسید ردوکتاز با فروسیانین کمپلکس تشکیل می دهد (Adam V , 2004). این کمپلکس بطور موثر با رادیکال های سمی اکسیژن واکنش می دهد و محصول نهایی واکنش پراکسید هیدروژن نیست
اما فورمات و H₂O تولید می­ شود (شکل 1).

شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن در (A) هوازی ها و ارگانیسم های بی هوازی (B و C). Cyt bd: سیتوکروم bd یوبی کوئینول اکسیداز. Prx: پروکسی ردوکسین، rd: روبردوگسین، SOD: سوپراکسید

دیسموتاز، SOR: سوپراکسید ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز.

 در این تحقیق در نظر است پروتئین DR2418 به صورت نوترکیب تهیه تا در تحقیقات آتی از آن استفاده شود.

به طور خلاصه اهدف این تحقیق به شرح زیر است:

_ با توجه به اینکه ژنهای ایجادکننده مقاومت به اشعه در باکتری Deinococcus radiodurans وجود دارد، می توان عملکرد این ژنها را در مقیاس آزمایشگاهی بررسی نمود. بنابراین هدف از این مطالعه، تهیة پروتئینی بود که در مقاومت باکتری نسبت به پرتو نقش دارد. در تحقیقات آتی میتوان از آن برای تهیة مواد ضدپرتو استفاده نمود.

_   کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بیانی pET21

_     بررسی میزان بیان پروتئین DR2418 در میزبان E.coli origami

_   خالص­سازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی

 بطور مستقیم و غیرمستقیم باعث تخریب DNA می شوند و تغییرات بازی و شکست دورشته و تک رشته DNA را بوجود می آورند. مطالعات نشان می دهد که 80% از تخریب DNA ناشی از عملکرد ROS است و فقط 20% توسط برهم کنش مستقیم فوتون های گاما و DNA است و تعداد شکست های DNA دو رشته ای نسبت مستقیم با اندازه ژنوم دارد (Gerard E , 2001). اولین مسیر حفاظت علیه استرس اکسیداتیو وجود آنزیم های آنتی اکسیدان همانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز است که بیومولکول ها را از آسیب هاب ناشی از ROS محافظت می کند (شکل 1). سوپراکسید دیسموتاز تبدیل اکسیژن را به سوپراکسید اکسیژن کاتالیر می کند تا در نهایت پراکسید هیدروژن به H₂O تبدیل شود (شکل 1). مطالعات نشان می دهد که D. radiodurans در هنگام مواجه با اشعه یونیزان سه نوع سوپراکسید دیسموتاز و سه کاتالاز کد می کند. در آرکی ها، سوپراکسید دیسموتاز توسط ارگانیسم­های هوازی (نظیر Halobacterium) و چند ارگانیسم بی هوازی مانند Methanosarcina barkeri کد می شود. در ارگانیسم های بی هوازی سوپراکسید ردوکتاز (SOR) کد می شود (شکل 1). سوپراکسید ردوکتاز در هنگام اکسیده شدن نیاز دارد تا توسط روبردوکسین احیا شود که خودش هم توسط آنزیم NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز (NROR) اکسیده می شود. در نهایت پراکسید به H₂O توسط عملکرد روبرترین تبدیل می شود. علاوه بر این، بعضی از ارگانیسم های بی هوازی، از مسیرهای بدون تولید پراکسید هیدروژن، برای حذف سوپراکسید استفاده می کنند (تصویر C1). مطالعات کریستالوگرافی نشان می دهد که سوپراکسید ردوکتاز با فروسیانین کمپلکس تشکیل می دهد (Adam V , 2004). این کمپلکس بطور موثر با رادیکال های سمی اکسیژن واکنش می دهد و محصول نهایی واکنش پراکسید هیدروژن نیست

اما فورمات و H₂O تولید می­ شود (شکل 1).

شکل 1. مسیرهای سمیت زدایی سوپراکسید اکسیژن در (A) هوازی ها و ارگانیسم های بی هوازی (B و C). Cyt bd: سیتوکروم bd یوبی کوئینول اکسیداز. Prx: پروکسی ردوکسین، rd: روبردوگسین، SOD: سوپراکسید

دیسموتاز، SOR: سوپراکسید ردوکتاز، NROR: NAD(P)H روبردوکسین اکسی ردوکتاز.

 در این تحقیق در نظر است پروتئین DR2418 به صورت نوترکیب تهیه تا در تحقیقات آتی از آن استفاده شود.

به طور خلاصه اهدف این تحقیق به شرح زیر است:

_ با توجه به اینکه ژنهای ایجادکننده مقاومت به اشعه در باکتری Deinococcus radiodurans وجود دارد، می توان عملکرد این ژنها را در مقیاس آزمایشگاهی بررسی نمود. بنابراین هدف از این مطالعه، تهیة پروتئینی بود که در مقاومت باکتری نسبت به پرتو نقش دارد. در تحقیقات آتی میتوان از آن برای تهیة مواد ضدپرتو استفاده نمود.

_   کلون کردن ژن dr2418 در وکتور pGEM وساب کلون کردن آن در وکتور بیانی pET21

_     بررسی میزان بیان پروتئین DR2418 در میزبان E.coli origami

_   خالص­سازی پروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی